15 KJEMI 1 2026 ingssted. Videre viste isoterm titreringskalorimetri (ITC) at forbindelsene binder til β-clamp med μM-affinitet. De fokuserte molekylene og ITC- kurvene er vist i Figur 2. Dersom kunnskap om binding er til stede fra andre data, kan denne delen av NMR arbeidet forenkles. Evaluering av ligand-protein binding ved bruk av 19F T2 NMR relaksasjons eksperimenter Når et molekyl binder til et protein, endres dets molekylære rotasjoner og dermed relaksasjonsegenskaper i NMR spektroskopi. I bioassay-sammenheng kan dette nyttiggjøres med såkalte Carr-Purcell-Meiboom-Gill puls sekvenser 4, 5. Kort fortalt, et fritt molekyl vil relaksere langsomt og vil gi et sterkt NMR signal (19F i dette tilfellet), mens et protein-bundet molekyl vil relaksere raskere og signalet blir svakt eller helt borte. Det brede 19F-spekteret, kombinert med fravær av fluor i biologisk materiale, gjør at risikoen for overlappende signal er minimal. En annen fordel er at umerket protein i lav mengde kan benyttes. I prinsippet kan man da screene hundrevis av forbindelser i én prøve. Assay-konseptet baserer seg på at man har et fluorholdig detektor molekyl, ofte kalt «spy», som binder middels godt til proteinet man ønsker å finne nye bindere til. Dersom detektor stoffet binder for godt til proteinet er det ikke egnet til slike analyser. Først blander man proteinet og detektor molekylet i et egnet medium avhengig av proteinets stabilitet. En 19F NMR analyse med den nevnte pulssekvens vil gi et spekter der signaler fra detektor molekylet er helt eller delvis borte. For å identifisere nye molekyler med binding kan man tilsette disse til den samme prøven. Dersom et av de introduserte molekyl binder sterkere enn detektor molekylet, vil detektor molekylet fortrenges fra bindingssetet. Dette observeres ved at 19F NMR signalet fra detektor molekylet øker. Figur 3 viser assayet med våre stoffer. Øverst til venstre vises proteinet (β-clamp) og detektor molekylet (R)-8e (grønn). Disse binder og danner er kompleks holdt sammen av intermolekylære ikke-kovalente krefter. Så tilsette test molekyler, i dette tilfellet bare et molekyl, (R,S)-8i, (lilla). I et ferdig utviklet assay trenger ikke disse å inneholde fluor, men vi valgte å gjøre det slik for å ha bedre kontroll. Figur 3A og 3B viser 19F NMR av henholdsvis detektor molekylet og test molekylet. Trifluoreddiksyre (TFA) ble her brukt som referanse standard. Så tilsettes proteinet (β-clamp) til prøve A, og ett nytt spekter opptas, se Figur 3C. Proteinet og detektor molekylet binder, og detektor molekylet relakseres raskt. Dette fører til at signalet fra detektor molekylet, (R)-8e, forsvinner. Nå er vi klare for å teste om ukjente forbindelser binder til proteinet. Da tilsettes test molekylet (R,S)-8i til prøve vist i Figur 3C. I dette tilfellet har test molekylet sterkere binding til β-clamp enn detektor molekylet, og fortrenger dette fra bindingssetet, se Figur 3D. Siden vi brukte et fluorert molekyl som test molekyl, observeres dette ved at signalet fra (R,S)-8i er nesten borte, mens signalet fra detektor molekylet dukker opp igjen. For å undersøke og visualisere analyseprinsippet i et større utvalg av forbindelser, ble en blanding bestående av den sterke binderen (R)-8e, den svakere binderen 8b, samt tre andre fluorerte for- bindelser, 9–11, undersøkt i samme type eksperiment, se Figur 4. Det øverste spekteret i grønt viser signalene fra stoffene uten β clamp. Det nedre spekteret i rødt viser samme type eksperiment, men med β-clamp. Tilsetning av β-clamp reduserte signalintensiteten til (R) 8e-betydelig, mens intensiteten til 8b kun ble marginalt påvirket. Signalintensiteten for forbindelsene 9–11 forble Figur 2. Representative ITC-kurver for titrering av β-clamp mot de respektive forbindelsene. Øverste panel viser baseline-korrigerte rådata, mens nederste panel viser de integrerte bindingsisotermene. KD-verdiene er beregnet som gjennomsnittet av tre målinger.
RkJQdWJsaXNoZXIy MTQ3Mzgy